核心词：桂花树 Cf-2 Rcr3pim 桂花 品系 根 线虫 抗性 
　　桂花根系单卵量的统计结果（图2D）表明,cf-0/rcr3pim、cf-2/rcr3-3和cf-2/rcr3pim品系的单卵量分别为442.1、428.2和303.6,而感病对照"贺州903"的单卵量高达448.2。与敏感和抗性对照相比,Cf-0/rcr3pim和Cf-2/rcr3pim菌株在雌性和卵子数量上存在显著差异,而Cf-2/rcr3-3菌株仅与抗性对照存在显著差异。根结线虫的综合防治策略包括植物检疫、农业防治、物理防治、生物防治、抗病品种利用和化学防治。其中,种植抗病品种是最经济有效的防治方法。许多国家都十分重视根结线虫的抗性育种和品种选育。虽然根结线虫的抗性基因在许多作物中已有报道,但真正用于农业生产的抗性资源仍然十分有限。
　　1、保障人类生活质量具有重要意义
　　根结线虫的防治对稳定粮食安全、保障人类生活质量具有重要意义。3天后,将发芽的种子播种在含有消毒土壤（土壤:细沙:营养土壤=3）的塑料杯中∶3）（直径7cm）×桂花高度12cm）,桂花在日光温室20～25℃～6叶期培养,进行RNA提取和线虫接种。从江苏省淮安市丁集镇黄瓜根部采集南方根结线虫种群。经单卵纯化和种属鉴定后,将其接种于感病的桂花‘合作903’上,在25℃的日光温室中繁殖。与敏感和抗性对照相比,Cf-0/rcr3pim和Cf-2/rcr3pim表现出显著差异;Cf-2/rcr3-3菌株与敏感对照之间没有显著差异,但与抗性对照相比存在显著差异（图2a）。统计接种桂花的根结率和根结指数,后果（表中显示,抗性对照"tanaki"的根结率和根结指数最低,分别为1.79%和20.00。抗性评定为高抗性,敏感对照"hezuo903"分别为50.25%和70.00,评定为中等敏感性。扩增条件:预变性在95℃下静置4min;95℃变性30s,60~65℃退火30s,72℃延伸1min和30s,循环35次;并在72℃下延长10min。本研究结果如下:结果表明,与其他两个菌株相比,同时表达Cf-2和rcr3pim基因的Cf-2/rcr3pim菌株虽然在一定程度上减少了成功感染线虫的数量,但不能有效抑制线虫的生长发育。Cf-2/rcr3pim品系的根结率和根结指数与感病对照"合作903"相近,仍是感病品种。根结线虫是一种重要的植物寄生线虫,感染3000多种植物,严重危害农作物的产量和品质,每年给全球农作物造成高达100亿美元的经济损失。结果表明,Cf-2/rcr3pim菌株可扩增370bp和400bp片段,与预测片段大小一致,表明Cf-2和rcr3pim基因均在根组织中表达,Cf-2的表达水平相对较低;从Cf-2/rcr3-3株中仅扩增出约370bp的Cf-2基因片段,未扩增出rcr3pim基因片段;从cf-0/rcr3pim株中仅扩增出约400bp的rcr3pim基因片段,未检测到cf-2基因的表达;然而在对根结线虫敏感的桂花‘合作903’和抗性桂花‘tanaki’中未检测到Cf-2和rcr3pim基因的表达（图）接种后的桂花幼苗在正常光照下置于20~25℃的温室中,定期用营养液浇水,桂花树但如果一个抗性品种长期连续种植,很容易使根结线虫突破Mi-1基因的抗性,成为有毒的popu导致品种抗性丧失。此外,当土壤温度高于28℃时,Mi-1基因将失去对根结线虫的抗性,不利于保护地栽培和夏季高温炎热地区的作物种植。因此,寻找新的抗根结线虫资源和材料防治根结线虫显得尤为迫切。
　　2、最成功的商业应用是来自秘鲁野生桂花的Mi-1基因
　　目前,最成功的商业应用是Mi-1基因,该基因来源于野生秘鲁桂花,对三种南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫具有抗性。Cf-2/rcr3pim是桂花茄属植物中的一对基因。Cf-2/rcr3pim共同介导桂花对木霉枝孢霉的抗性,其机制符合"警戒假说",即木瓜半胱氨酸蛋白酶rcr3pim能识别木霉的脱毒蛋白AVR2,从而刺激Cf-2介导的桂花对木霉菌的抗性。
　　3、即马铃薯金线虫分泌一种毒液过敏原蛋白grvap1
　　Cf-2/rcr3pim桂花在预防马铃薯金线虫globoderarostochiensis感染方面也有类似的作用,即马铃薯金线虫分泌一种毒液过敏原蛋白grvap1,桂花的rcr3pim可与grvap1特异性结合,刺激Cf-2介导的抗性反应,从而有效减少马铃薯金线虫成功感染的次数。cf-0/rcr3pim和cf-2/rcr3-3菌株与敏感对照之间无显著差异,但cf-2/rcr3pim菌株与敏感对照之间存在显著差异。
　　4、观察和计数根上的雌性和卵块数量
　　观察并计数根上的雌性和卵块数量,其结果与上述结果相似（图2B,c）。cf-0/rcr3pim、cf-2/rcr3-3和cf-2/rcr3pim根上的平均雌性数量分别为249.0、210.0和125.3/株,卵团数量分别为134.6、110.0和71.3/株,而感病对照"合作903"的雌性数量和卵团数量分别为196.7/株和103.7/株,抗病对照‘tanaki’根中的雌性数量仅为1.7/株,并且没有卵块。结果表明,与分别表达Cf-2和rcr3pim基因的Cf-2/rcr3-3和Cf-0/rcr3pim株系相比,表达这两种基因的Cf-2/rcr3pim株系的根瘤数、雌虫数和根上卵量显著减少,表明该菌株能在一定程度上减少线虫的感染。为探索新的根结线虫抗性材料,采用室内人工接种法测定了不同品系Cf-2/rcr3pim桂花对南方根结线虫的抗性。这些菌株包括Cf-2/rcr3pim、rcr3pim基因突变株Cf-2/rcr3-3和杂交株Cf-0/rcr3pim。从每个桂花根系中随机抽取6个卵,置于含5.32×10-5mol/lnaclo溶液的12孔板中,在立体镜下计数单个卵块中的卵数;对每个菌株重复3次。接种45天后,从塑料杯中取出桂花植株,切去地上部分,冲洗根部,用1.04×10-4mol/L台盼蓝溶液浸泡20分钟,用清水冲洗掉多余的染色液,用吸水纸擦干。计算桂花根结数、卵量和根与根在整个根系中的比例。每种桂花材料设6次重复。根用酸性品红染色,立体镜下计数根中的雌性数量;对每个菌株重复3次。
　　5、Cf-2/rcr3-3和Cf-0/rcr3pim基因型的桂花品系中Cf-2和rcr3pim基因的表达水平是否存在差异
　　为了确认Cf-2/rcr3pim、Cf-2/rcr3-3和Cf-0/rcr3pim基因型的桂花品系中Cf-2和rcr3pim基因的表达水平是否存在差异,我们使用桂花肌动蛋白基因作为内部参考,并使用表1中的Cf-2和rcr3pim基因特异性引物检测受试桂花材料。采用Spss1000和Duncan的新复差分法分析差异显著性。15g/L琼脂糖凝胶电泳30min（电压120V）,溴化乙锭染色15min,在凝胶成像系统下观察并拍照。接种线虫前,6叶期在距桂花茎基2cm的土壤中均匀钻4个4～6cm深的孔,每个孔接100个2龄幼虫,每个苗接种400个J2。
　　6、观察并计数了不同桂花品系的繁殖情况
　　在接种南方根结线虫45天后,观察并统计了不同桂花品系根结线虫的繁殖情况。
　　7、结果表明
　　结果表明,仅表达rcr3pim基因的cf-0/rcr3pim株系形成的根结数最多,平均为180.6个/株,仅表达cf-2基因的"cf-2/rcr3-3"株系形成的根结数为145.1个/株,同时表达Cf-2和rcr3pim基因的Cf-2/rcr3pim菌株形成的根节最少,每株仅101.3个;感病对照"合作903"的根瘤数为144.4个/株,抗性对照"tanaki"的根瘤数仅为5.3个/株。根节点索引的计算公式为:根节点索引=∑（各级病株数）×各级代表值）/（调查总株数×最大严重度（代表值）
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